Ruolo delle Cappe per FIV nei Laboratori FIV

Fattori esterni che influiscono sull’ovocita e sull’embrione in Vitro

Durante tutta la manipolazione degli ovociti/embrioni essi devono essere protetti da cambiamenti fisici/chimici, nello specifico:

• Variazioni di temperatura
• Osmolarità e pH del terreno di coltura
• Qualità dell’aria

A. Temperatura

• L’ovocita (cellula germinale femminile in fase di sviluppo) è  estremamente sensibile a variazioni di temperatura.
• Variazioni di temperatura possono influire sul trasporto trans-membrana e molti processi metabolici.
• L’ovocita umano e l’embrione devono essere mantenuti a una temperatura il più stabile possible di 37 °C.
• La temperatura influenza anche I valori di pH del campione.
• Processi di evaporazione influiscono sul valore di pH del campione.
• Un aspetto significativo ma scarsamente riconosciuto, del controllo della temperature durante l’osservazione al microscopio dell’ovocita e dell’embrione nei piatti, è che il design di tutti I piatti consumabili in plastica non permette alla base del piatto di entrare in contatto con il support del microscopio in quanto è  sempre presente uno strato di aria (vedere Figura). Essendo l’aria uno scarso conduttore di calore, questo strato di aria reduce notevolmente l’efficacia degli stadi di riscaldamento (anche I supporti attaccati o costruiti come parte del microscopio, o le superfici di lavoro riscaldate dell’armadio, causano il raffreddamento del terreno al di sotto della temperature alla quale è  stato impostato il riscaldamento della superficie.

B. Osmolarità e pH del terreno di coltura

La composizione dei terreni di cultura usati per IVF umana è evoluta notevolmente negli anni recenti grazie a un aumento della diffusione dell’uso di terreni di coltura “sequenziali” che comprendono un range di terreni e buffer designate a fornire un supporto ottimizzato per ogni stadio del processo dal recupero degli ovociti alla fecondazione, scissione degli embrioni fino alla blastocisti.

Un uso corretto di tutti I terreni di coltura richiede l’uso di specifiche atmosphere che sono, come minimo, arricchite di diossido di carbonio.

Inoltre, è  ad oggi riconosciuto che l’embrione umano mostra un miglior sviluppo, e potenziale di impianto, se la tensione dell’ossigeno è ridotta rispetto al valore in aria normale. Tuttavia c’è una grande confusione tra concentrazione di CO2 e O2 (espresso in termini di percentuale volumetrica) e la loro pressione parziale. Per prima cosa a maggiori altitudini, non solo la pressione atmosferica decresce, ma anche le relative porzioni di ossigeno e nitrogeno (e gli altri gas minori) cambiano: per esempio, se la percentuale di ossigeno a livello del mare è del 20.95%, a una altitudine di 1000 m è solo dello 18.55% O2 e a 1600 m (es. Denver) arriva al 17.2%. Le stesse variazioni influenzano la CO2, di conseguenza se si vuole ottenere un pH di 7.3 in una soluzione di 25 mm di bicarbonato a livello del mare, è  richiesto il 6.0% di CO2 in accord all’equazione di Henderson-Hasselbach, altrimenti il pH si modificherà e gli ioni di bicarbonate verranno persi fino a quando la soluzione non raggiungerà un nuovo equilibrio. Ma a 1600 m sul livello del mare, è  richiesto quasi il 7.5% CO2 per avere la corretta pressione parziale (ppCO2) necessaria a mantenere gli ioni di bicarbonate in soluzione e il pH a 7.3.

Uno dei problem principali con terreni di coltura tamponato a base di bicarbonato è che richiedono molto tempo per raggiungere l’equilibrio, ma la Perdita di gas è  molto rapida. Studi recenti [4] hanno mostrato che una goccia di 50 µl di terreno sotto olio dopo la rimozione dall’incubatore CO2 arriva a un pH di 7.45 entro 2 min e che dopo dopo riposizionamento della piastra nell’incubatore CO2 impiega 35 minuti per riequilibrare il pH (solo circa 15 min per piastre Petri contententi 5ml di terreno). Queste differenze sono dovute al rapporto tra I valori della CO2 nel terreno e nell’aria e tra atmosfera nell’incubatore e terreno parzialmente degasato.

Infine, se il terreno di coltura è  esposto a aria non ben saura di vapore acqueo allora ci sarà una perdita evaporativa dal terreno con conseguente aumento dell’osmolarità media. L’evaporazione è  anche maggiore a temperature più miti. Sebbene l’olio aiuti a combattere questo problema, durante  il prelievo dell’ovocita le piastre sono solitamente aperte senza uno strato di olio (che complicherebbe enormemente la procedura).

C. Qualità dell’aria

A causa del loro elevato metabolismo e della divisione cellulare, gli embrioni sono altamente sensibili a sostanze chimiche tossiche, rendendo così i laboratori di FIV/ART e le sale di procedura aree particolarmente ad alto rischio di composti organici volatili (VOCs) e altri inquinanti atmosferici.

Un’errata convinzione diffusa è che I filtra HEPA (high efficiency particulate air) rimuovano molecole gassose organiche e inorganiche. HEPA, come implica il nome, è  un sistema altamente efficiente di filtraggio per la rimozione del particolato dall’aria (lo standard richiede un 99.97% di efficienza per 0.3 µm di particolato), non di molecole gassose a basso peso molecolare.